骑士团直到1530年才拥有自己的领土，当时大团长菲利普·德·维利耶（Fra' Philippe de Villiers de l'Isle Adam）占领了马耳他岛（Malta）。

该岛是由神圣罗马皇帝查理五世和他的母亲卡斯蒂利亚女王琼娜（Queen Joanna of Castile）以西西里国王的身份授予骑士团的，得到了教皇克莱门特七世（Pope Clement VII）的批准，骑士团因此需遵守《马耳他猎鹰的贡品》（Tribute of the Maltese Falcon）的条件。

在1565年，骑士们在大团长让·德·瓦莱特（Fra' Jean de Valette，曾在土耳其船上和德拉古特一起划桨）的领导下，成功防御了奥斯曼帝国的围攻，持续了三个多月。

骑士团的舰队在1571年的莱班托海战（Battle of Lepanto）中对奥斯曼海军力量的最终摧毁做出了贡献，该战役由西班牙国王菲利普二世（King Philip II of Spain）的异母兄弟奥地利的约翰（John of Austria）指挥。

宗教改革将西欧分裂为新教和天主教国家，对骑士团也产生了影响。

在包括英格兰、苏格兰和瑞典在内的多个国家，骑士团解散。

在其他国家，如荷兰和德国，部分司法区或指挥部（骑士团的行政区划）经历了新教转变。

这些“约翰骑士团”在德国、荷兰、瑞典以及包括美国和南非在内的许多其他国家存续下来。

骑士团被确立为在任何基督教国家之间的战争中保持中立。

从1651年到1665年，骑士团统治了加勒比海的四个岛屿。

在1651年5月21日，它购买了圣巴瑟米岛（Saint Barthélemy）、圣基督山（Saint Christopher）、圣克鲁瓦岛（Saint Croix）和圣马丁岛（Saint Martin）。

这些岛屿是从刚刚解散的法国外岛公司（Compagnie des ?les de l'Amérique）手中购买的。

到1665年，这四个岛屿被出售给了法国西印度公司（French West India Company）。

---

1798年，拿破仑领导法国占领马耳他。

拿破仑要求大团长费迪南德·冯·霍姆佩施·祖·博尔海姆（Ferdinand von Hompesch zu Bolheim）允许他的舰船进入港口，补给水和物资。

大团长回复说，每次只能允许两艘外国船只进入港口。

拿破仑意识到这一程序将耗费时间，令他的军队暴露在英国海军上将霍雷肖·纳尔逊（Admiral Horatio Nelson）面前，于是立即下令对马耳他发起炮击。

法国士兵于6月11日早晨在七个登陆点登陆马耳他并发动攻击。

经过数小时的激烈战斗，西部的马耳他人被迫投降。

拿破仑与堡垒首都瓦莱塔（Valletta）展开谈判。

面对远远强于自己的法国军队和西马耳他的失守，大团长同意投降。

霍姆佩施于6月18日离开马耳他前往的里雅斯特（Trieste）。

他于1799年7月6日辞去大团长职务。

骑士们虽然分散，但骑士团依然以减弱的形式存在，并与欧洲各国政府谈判，寻求在德意志中介化过程中重新获得权力。